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ELISA在獸藥殘留檢測中的應用

   獸藥殘留分析技術(shù)是復雜混合物中的痕量分析技術(shù)，現(xiàn)代方法通常包括樣品的前處理（提取、凈化、濃縮和衍生化）和測定兩部分。zui初，殘留分析技術(shù)極限于化學分析法、比色法和微生物法?；瘜W分析法和比色法缺乏專一性和敏感性，而微生物法雖然普通適用于抗菌藥物的殘留測定，但不易篩選到特別敏感的菌株，方法常受到其他抗菌藥物的影響。薄層色譜（TLC）操作簡單，結(jié)果可靠，但乃需要復雜的樣品前處理，靈敏度不高。20世紀60年代后的GC 和七八十年代后的質(zhì)譜（MS）、HPLC以及GC-MS、LC-MS等聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展大大地提高了分析的靈敏度和分辨率，拓寬了殘留分析范圍。HPLC和GC等方法較之微生物法有高度的靈敏度和特異性，但設(shè)備昂貴，對實驗人員也有較高的要求，分析費時而不易推廣。同時它還需要復雜煩瑣的樣品前處理且不能同時篩選大量的樣品，這對藥物殘留的及時監(jiān)控無疑是不合適的。20世紀90年代后，免疫檢測技術(shù)飛速發(fā)展，大大推動了獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展的進程，一系列免疫檢測試劑盒的生產(chǎn)與應用加快了獸藥殘留分析的標準化。目前普遍應用于獸藥殘留分析的是酶免疫檢測法，其研究過程一般包括人工抗原的合成、抗體的制備以及檢測方法的建立等步驟。但絕大多數(shù)藥物是小分子物質(zhì)，分子量小于1KDa，沒有免疫原性，必須把它交聯(lián)到大分子蛋白質(zhì)上制備人工抗原來獲得免疫原性。因此獸藥的免疫檢測有其自身的特點。單克隆抗體在靈敏度和交叉反應方面都優(yōu)于多克隆抗體，且具有均一性、專一性和*性等特點，有利于標準化。

     內(nèi)酰胺類

Rose等用頭孢噻呋的水解產(chǎn)物去呋喃羰基頭孢噻呋作為半抗原，將其原位交聯(lián)到載體蛋白BSA和KLH上制備了兩種人工抗原，免疫BALB/c小鼠后zui終篩選出兩株單克隆抗體，cef-68和cef-116,并以之建立了檢測頭孢噻呋的Ci-ELISA方法，cef-68和cef-116的IC50分別為32ug/kg和0.33ug/kg,，其檢測限分別為32ug/kg和0.33ug/kg。單克隆抗體對頭孢噻呋有較高的選擇性，交叉反應的數(shù)據(jù)表明只有少數(shù)頭孢菌素與之有交叉反應，而青霉素則與之沒有交叉反應。

     氟喹諾酮類

     Holtzapple等先將載體蛋白BSA、卵清蛋白OVA用過量的乙二胺處理后碳二亞胺法合成了cOVA-Sara和cBSA-Sara兩種沙丁沙星人工抗原。以cBSA-Sara免疫BALB/c小鼠，

用cOVA-Sara作包被原篩選出了6株單克隆抗體，并以之建立了檢測沙丁沙星的Ci-ELISA方法。標準曲線的IC50范圍為7.3~48.3ug/kg,批內(nèi)相對標準偏差11.0%（n=3）,批間相對標準偏差10.8%（n=3）,檢測限為2 ug/kg。組織樣品在10 ug/kg 、50 ug/kg、100 ug/kg的添加水平下回收率分別為132%、78%和81%。交叉反應數(shù)據(jù)表明單抗對沙丁沙星有很高的選擇性。

      Duan等制備了環(huán)丙沙星多克隆抗體，并建立了檢測環(huán)丙沙星殘留的Ci-ELISA方法，檢測限為0.32ng/mL標準曲線0.32ng/mL~5000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)和批間相對標準偏差分別為5.81%和11.23%。環(huán)丙沙星在豬肉、雞肉及牛乳中的回收率分別為75.58%、81.2%和84.5%。抗血清與思諾沙星的交叉反應率為69.8%，與金霉素、慶大霉素、青霉素、新霉素、喹乙醇和磺胺等無交叉反應。蔡勤仁等制備了恩諾沙星單克隆抗體，Ci-ELISA的zui低檢測限為0.13ng/mL。

     磺胺類

      李喜旺等制備了6種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和3種多克隆抗體，并對抗體的選擇性與親和性，免疫原與靶物質(zhì)的免疫相關(guān)性和免疫反應條件進行了探討。部分抗體對參試的9種磺胺類藥物顯示了高度的選擇性和親和性，其中7種藥物Ci-ELISA抑制曲線，檢測限低于0.01 ug/mL,并在PH=4.4~5.4的介質(zhì)中親和性zui強。Sheth等制備了多種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和多克隆抗體，并以建立了檢測磺胺類藥物的Ci-ELISA方法。吳定等以BSA為載體合成兩種不同摩爾比值（1：13和1:42）磺胺甲基嘧啶人工抗原并比較其免疫原性。免疫家兔后獲得抗磺胺甲基嘧啶（SMD）多克隆抗體，并以之建立了乳中磺胺甲基嘧啶殘留的Ci-ELISA方法，標準曲線的工作濃度為5~20ng/Ml,檢測限為2.4ng/ML回收率88%~118%。抗血清與磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉反應率分別為6.0%和0.84%，而與其他磺胺類藥物無交叉反應。研究結(jié)果還表明半抗原與載體蛋白的結(jié)合比在1:10~1:25為宜。劉智宏等用戊二醛法合成了SQ-BSA人工抗原并用其免疫家兔制備了SQ多克隆抗體，并以之建立了Ci-ELISA方法，標準曲線的線性關(guān)系良好，檢測限為100uL/L,回收率為93.7%，批間相對標準偏差6.4%?？寡鍖?/span>SQ有很高的選擇性，在12種磺胺類和非磺胺類藥物中，zui大交叉反應率僅為0.1%。

     生長激素類

     陳繼明等分別以偶氮方法和碳二亞胺法將B2受體激動劑克侖特羅（CL）和塞曼特羅（CIM）交聯(lián)到載體蛋白BSA和OVA上制成人工抗原，免疫家兔后分別制備了兔抗CL和CIM抗血清，并在此基礎(chǔ)上建立了CL和CIM殘留的免疫檢測方法。兩種抗血清的工作濃度分別為1:1.0X10（3）。CL和CIM的檢測范圍分別為1.9-15.6ng/mL和0.477-1.85ng/mL。何方洋等用重氮化法制備了克侖特羅人工抗原并獲得了一株穩(wěn)定分泌抗克侖特羅單克隆抗體。Shelver等制備了萊克多巴胺單克隆抗體。Elliott等在山羊體內(nèi)獲取了萊克多巴胺多抗，并建立了分析牛尿液樣品中萊克多巴胺殘留的ELISA方法，該研究表明ELISA方法與LC-MS方法的相關(guān)性很好。

       聚醚類離子載體抗球蟲藥

      Muloon等制備了鹽霉素人工抗原SAL-BSA，并以之免疫BALB/c小鼠，篩選出16株單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了檢測鹽霉素的Ci-ELISA方法。單抗對鹽霉素有很高的選擇性，能識別甲基鹽霉素而與拉沙里菌素和莫能菌素沒有交叉反應。該研究還比較了HPLC和ELISA兩種方法，結(jié)果表明兩種方法有很好的相關(guān)性（P＜0.001），但ELISA方法更靈敏，其檢測限（50ug/kg）較HPLC（100ug/kg）低。Mount等建立了莫能菌素的免疫檢測方法，檢測限為2ng/ML。沈建忠等用混合酸酐法和活性酯法合成了5個馬杜霉素人工抗原，以M-KLH免疫家兔制備了兔抗馬杜霉素抗血清，抗血清工作濃度為1:1.6X10（3）-1:2.56X10（4）,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測馬杜霉素的Ci-ELISA方法，用M-C6-OVA作包被原，馬杜霉素標準曲線的IC50值為30.1 -32.3ng/ML，斜率為2.20-2.55（介質(zhì)為PBS-10%甲醇），交叉反應數(shù)據(jù)表明抗體對馬杜霉素的特征結(jié)構(gòu)具有較高的選擇性。

      抗蠕蟲藥

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      Brandon等制備了苯并咪唑株單克隆抗體，建立了檢測苯并咪唑類抗蠕蟲藥的Ci-ELISA 方法。該方法可檢測出1-8ug/kg濃度范圍的苯并咪唑類抗蠕蟲藥 及其代謝產(chǎn)物和甲基苯并咪唑的殘留。且該方法與HPLC方法在檢測用芬苯噠唑處理的奶牛肝組織殘留時有很好的相關(guān)性。當在牛肝臟樣品中添加等量的苯并咪唑類藥物、亞砜和砜等代謝產(chǎn)物時，阿苯達唑和芬苯噠唑的檢測限分別為58 ug/kg和120 ug/kg 。單抗對苯并咪唑抗蠕蟲藥有很高的選擇性。Holtzapple等用碳二亞胺法，戊二醛修飾載體法和疏基修飾載體法合成了多個潮霉素B人工抗原，免疫BALB/C小鼠zui終篩選出7株抗潮霉素B單克隆抗體，并建立了檢測潮霉素B的Ci-ELISA方法。平均批內(nèi)相對標準偏差7.8%（n=3）,批間相對標準偏差7.0%（n=3）,zui低檢測限為0.25mg/kg。組織樣本在1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的添加水平，回收率分別為83%、82%和91%。單抗對潮霉素B有很高的選擇性，與結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷沒有交叉反應。Bushway等制備了噻苯達唑多克隆抗體，并建立了檢測噻苯達唑Ci-ELISA方法，整個分析費時35min（包括樣本準備），能同時分析8個樣品，檢測限為9ug/kg,批內(nèi)相對標準偏差5.0%-9.6%，批間相對標準偏差為4.4%-15%。在50-5.0X10（4） ug/kg添加水平下平均回收率為116%。

     阿維菌素類

李俊鎖等制備了阿維菌素（AVM）人工抗原。研究了牛組織（血漿、肌肉和肝）中阿維菌素殘留的ELISA  反應條件和樣本前處理方法，并對添加樣本進行了測定。AVM標準液的IC50為1.8-4.0ng/mL，檢測限為0.02-0.2 ng/mL樣本經(jīng)甲醇一次提取和稀釋后直接進行檢測，各樣本中AVM的IC50為3.6-30.2 ng/mL，樣本檢測限為0.1-0.6 ug/kg.。在6.0-60.0 ug/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為87.9%-108.8%，相對標準偏差為2.8%-16.9%。Schmidt等用伊維菌素和阿巴美?。?/span>Abamectin）的衍生物4〞-0-（單）琥珀酸鹽碳二亞胺法制備了多種伊維菌素人工抗原篩選到C4D6等5株單克隆抗體。C4D6對伊維菌素和Abamectin的檢測限分別為0.5ug/kg和1ug/kg，標準曲線的IC50分別為3 ug/kg和7ug/kg.。

其他

覃雅麗等制備了氯霉素單克隆抗體，Ci-ELISA的zui低檢測限為0.1 ng/mL.Stanker等制備了呋喃苯胺酸（利尿藥）單克隆抗體，并建立了檢測乳中呋喃苯胺酸的Ci-ELISA方法，檢測限為2 ug/kg.。Abad和Montoya用碳二亞胺法合成了兩種卡巴立（殺蟲藥）人工抗原，免疫BALA/c小鼠后獲得了抗卡巴立單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測卡巴立的Ci-ELISA方法。Tanaka等制備了大觀霉素多克隆抗體，Ci-ELISA方法的檢測限為2 ng/mL.

獸藥殘留的免疫檢測技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展，已經(jīng)取得了可喜的進步，但也存在很多不足?？傮w說來，國外的獸藥殘留檢測無論是常規(guī)技術(shù)還是免疫技術(shù)的發(fā)展都滯后于農(nóng)藥和食品的殘留分析，而國內(nèi)這些都起步較晚，僅僅是初具規(guī)模，還沒有規(guī)范化和系統(tǒng)化。絕大多數(shù)獸藥殘留的免疫檢測方法都沒有建立。這既有國家對此的認識不足，投資了度不夠等主觀原因，也受到其本身的客觀原因所限制。如藥物的人工抗原較難合成，且免疫檢測技術(shù)雖然有取樣量少、前處理簡單、容量大、儀器化程度低、分析成本低、效率高、靈敏等優(yōu)點，但是所提供的待測物組成或結(jié)構(gòu)方面的信息太少，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。未來獸藥殘留免疫檢測發(fā)展的主要趨勢在以下幾個方面。（1）集中人力物力制訂一系列的國家標準，規(guī)范獸藥殘留免疫檢測的方法、步驟、試劑等和培訓專業(yè)人員。（2）免疫檢測與其他常規(guī)方法的聯(lián)合可使殘留分析融免疫分析的高選擇性和理化分析的快速、靈敏性于一體，避免了單純免疫檢測樣本時信息太少，定量準確性不足，或理化分析方法選擇性的弊端，使分析過程簡化，分析質(zhì)量得到改善。如先用免疫檢測對大批量樣品進行篩選再用其他常規(guī)方法確證，或利用抗血清制備的免疫柱（IAC）先將樣品凈化再用常規(guī)方法分析等。（3）免疫檢測技術(shù)的發(fā)展也將帶動要理研究的發(fā)展，如藥物單抗與基因重組技術(shù)的聯(lián)合應用可以反過來研究藥物的耐藥機制，有利于新藥的開發(fā)。

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ELISA在捕食作用研究中的應用

長期以來，捕食者和獵物之間的相互關(guān)系問題一直是生態(tài)學研究的中心課題之一。昆蟲學家采用了許多不同的方法來研究這種關(guān)系，希望能正確評價捕食性天敵對目標害蟲的控制作用。在諸多的方法，以血清學方法zui能獲得捕食作用的直接證據(jù)。血清學方法的理論依據(jù)在于：天敵消化道內(nèi)存在可與抗體反應的獵物蛋白。

利用血清學試驗來分析捕食者消化道內(nèi)含物的歷史已有40年。zui先采用的是沉淀試驗、雙向擴散法、單項擴散法、對流免疫電泳、交叉免疫電泳等。沉淀試驗既不敏感也不專一，由于其所需的設(shè)備簡單、費用低、易于解釋試驗結(jié)果，因此有不少人采用。隨著免疫學技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的技術(shù)不斷被采用，并朝高靈敏度和特異性的方向發(fā)展。在過去的十多年里，人們相繼引用了間接（被動）凝聚試驗、放射免疫試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。前兩個試驗因其過于復雜而未被廣泛采用，且放射免疫試驗費用高也不安全。

zui早將ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后，Ragsdale等應用ELISA研究了大豆上一系列捕食者（不包括蜘蛛）對稻綠蝽（Nezara viridura）的捕食作用：Miller用ELISA能將瘤額大小蠢（Dendroctonus  frontalis）從許多甲蟲中區(qū)別出來，并指出了該方法在捕食者-獵物關(guān)系研究中的潛在應用價值。目前，用ELISA研究捕食作用zui有成效的應數(shù)Sunderland等人的工作。他們對麥蚜的廣食性捕食者的捕食作用進行了廣泛而深入的研究。在野外與實驗室研究的基礎(chǔ)上，總結(jié)和改進了捕食作用的定量評價方法。而國內(nèi)除黃葵等用ELISA定性研究了枯蟲的捕食性天敵作用評價中的研究方法進行了總結(jié)，并結(jié)合研究結(jié)果分析了ELISA的應用價值，指出了有待進一步研究的問題。

方法

（1） 抗原的聶取  任何血清學試驗都依賴于具有價、特異性強的抗血清的產(chǎn)生，而抗血清的制備離不開抗原的收集、保存和提取。采回的害蟲饑餓24h后，將等體積的磷酸緩沖液（PBS）滴入備用的害蟲中，研磨后加入過量的PBS（PH=7.4）,在4℃下攪拌24h,然后以4000-5000r/min的速度離心20h,分離上清液。沉渣用上法重復抽提一次。

將兩次所得的上清液混合后，置于4℃下更換多次冷鹽水透析24h或48h。透析液用冰凍干燥法或反透析法進行濃縮。濃縮液用紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)含量，得到適當濃度的蛋白質(zhì)溶液即位抗原。

  抽提過程中應注意：①所有的處理都需在低溫（4℃）下進行，以防蛋白質(zhì)變性：②若抗原溶液需保存較長的時間，則需加防腐劑（如NaN3）或在凍干狀態(tài)下保存：③為制備特異性強的抗血清，抗原可用標準的生化技術(shù)進行純化：④如一次不能收集足夠的抗原，可將每次的蟲體保存在-20℃或?qū)⒖乖瓋龈芍钡椒e累足夠的量。

 （2）抗血清的制備

 ① 所需的抗原量   一般1-10mg/mL。

②免疫途徑   抗原的注射方法有皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射和淋巴結(jié)注射等。其中以靜脈注射zui為簡單方便，不需要佐劑乳化，產(chǎn)生抗體的高峰值出現(xiàn)較早，一般在一周左右，注射后一周即可采血測試效價。免疫過程中應注意：a.佐劑只能現(xiàn)配現(xiàn)用：b.采血時間不宜拖得太長。因為免疫時間越長，產(chǎn)生交叉反應的抗體也越多。

③抗血清的分離   當?shù)玫綕M意的效價時，即可進行取血。將收集到的血液成斜面放置在37℃、溫箱中2h。然后置于4℃冰箱過夜。次日用滴管吸取抗血清，用離心法（2000-3000r/min,20min）去掉沉淀。然后測定效價、鑒定純度。純度用紫外分光光度計或Folin氏比色法進行測定。抗血清保存于-25℃低溫處。

 ④抗血清的效價測定    測定的方法一般有兩種，即試管沉淀法和免疫雙擴散法。對于免疫酶技術(shù)使用的抗血清，必須具有一定的效價，試管沉淀法應不低于1:2，免疫雙擴散法不低于1:2，且要求單價抗血清。

 （3）捕食者的收集和準備     主要方法有3個：①將胃內(nèi)含物擠在質(zhì)量好的濾紙上，但蛋白質(zhì)易與纖維素結(jié)合，若保存過久則難以洗脫：②將待檢查的捕食封閉在明膠膠囊內(nèi)，并加干燥劑，以使蟲體與膠囊分離：③盡可能快地將采集到的捕食者儲存于低溫下（如-40℃）。前兩種方法適于郵寄和長途運輸，后一種方法能保存較長的時間。所有的方法都需保持干燥。對較大的捕食者，可將消化道分離，像蟻、蝸牛以及蜘蛛等小型動物則整個蟲體。（4）酶聯(lián)抗體的制備  按戊二醛簡易法進行。

  （5）酶聯(lián)免疫吸附試驗

       ①直接法    該方法直接利用抗原 與酶聯(lián)抗體的結(jié)合，較簡單易行。A.假抗原。在聚苯乙烯酶標版的孔穴中加入待檢測的抗原（捕食者胃內(nèi)含物抽提液）0.2mL，在4℃冰箱中過夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。B.洗滌兩次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液體盡量流出。c.加酶聯(lián)抗體。 各孔穴中加入酶聯(lián)抗體0.2mL，在mL37℃下孵育3h，使其充分結(jié)合。d. 加底物。 用PBS充分洗滌以除去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體，然后加入底物（鄰苯二胺）0.2 mL，于37℃反應30min，用2mol/L硫酸0.05 mL終止反應。e. 用ELISA檢測儀測定其吸光度值，分別設(shè)陽性、陰性和空白對照，以確定陽性反應臨界值。

        ②雙抗體夾心法   該方法與直接法的不同在于吸附抗體。a. 包被抗體。酶標板的孔穴中加入0.2 mL抗體（用PH=9.6/0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋），置37℃水浴中孵育3h,移入4℃冰箱過夜。將各孔中多余的抗體傾去，加入PBS洗滌，立即甩去，再將PBS加滿各板孔，置5min,甩去溶液，如此洗滌2次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液體盡量流出。b. 加待檢抗原。沒孔中加入待檢捕食者胃內(nèi)含物抽提液0.2 mL.同時設(shè)陽性、陰性和空白（PBS）對照，37℃水溶中孵育3h，轉(zhuǎn)入冰箱中過夜。如上法洗滌3次。C. 加入酶聯(lián)抗體。每孔加入酶聯(lián)抗體0.2 mL，37℃水浴孵育2h，如上法洗滌3次。d. 加底物。 每孔加入底物鄰苯二胺0.2 mL, 37℃水浴孵育1h,加入2mol/L硫酸0.05，以終止反應。e. 用 ELISA檢測儀測定其吸光度值。

       ③間接法  與前兩種方法不同點在于酶聯(lián)抗體與抗原的間接結(jié)合。a. 每孔加入待檢抗原0.2 mL ，4℃冰箱中過夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。并依上法洗滌3次。b. 每孔加0.2 mL,用PBS稀釋的抗體，37℃孵育2-3h。c.用PBS洗滌3次后，加入溶于PBS的酶聯(lián)抗體0.2mL，37℃孵育2-3h。d. 加底物，方法同上。e. 用ELISA檢測

方法評價

     ELISA具有許多優(yōu)良特性。盡管有些處理需要*化條件，但只要按要求去做，就十分簡單明了，并容易掌握。尤其是該方法不需要花費大量的時間作野外觀察，供試所采集的材料可收集起來并存一段時間，特別適用于一些只取食汁液而不取食獵物硬殼的捕食者胃內(nèi)含物分析，因為獵物的堅硬部分沒有留在捕食者消化道或排泄物內(nèi)。同時，高靈敏度、特異性、可重復性以及每次可處理大量材料使得該檢測法或得了滿意的效果。這是一般的血清學方法不能比擬的。該方法的一個缺點是在陰性反應中總有一定的顏色產(chǎn)生，必須要有一個標準來確定陽性反應的臨界點。

   目前，除繼續(xù)推廣ELISA在捕食作用研究中的應用及發(fā)展更為有效的方法外，還有兩個問題需進一步研究。一是環(huán)境因子，尤其是溫度對獵物在捕食者胃內(nèi)殘存時間的影響，目前的研究還無法考慮不同溫度下消化速率的差異：二是需要對實驗室或得的數(shù)據(jù)與田間的進行比較分析，并對陽性反應率進行校正。這些問題的研究將有助于定量評價捕食作用。

     捕食作用的定量評價

   捕食作用的定量評價是昆蟲生態(tài)學家所希望解決的課題之一，但對生活在自然界的捕食者來說，其捕食作用受到各種環(huán)境因子的影響，它每次的捕食量和捕食后的消化速率是未知的。因此，要對捕食作用進行定量分析就存在很大困難。然而，如果消化的時間和每次取食的量通過實驗研究確定的話，則對捕食數(shù)量進行估計是可能的。尤其是ELISA的應用，為實現(xiàn)這種可能提供了保證。SOpp等對已有的工作進行了總結(jié)，并提出了一種改進的定量評價。張文慶等也提出了功能反應-血清法來定量評價捕食作用。迄今為止，定量評價的公式5能較好地擬合實驗結(jié)果。而公式2的擬合效果zui差。但根據(jù)公式要得到準確的定量評價結(jié)果仍是困難的。

     ELISA在捕食作用定量評價上的應用

     張古忍應用ELISA定量評價了食蟲溝瘤蛛（Ummeliata insecticeps）對稻飛虱的捕食作用。將ELISA檢測的A值轉(zhuǎn)化為捕食量，采用公式5便能計算出食蟲溝瘤蛛種群對稻飛虱的捕食總量，但設(shè)定消化系數(shù)（f）為1.其中Qo可通過以下方法求得：每一個表現(xiàn)為陽性反應的捕食性天敵都有一對應的A值，假定捕食作用剛剛完成，消化道內(nèi)的蛋白質(zhì)尚未消化，那么剛剛捕食一頭獵物所測出的A值就代表了一頭獵物用此A值與標本檢測所得的A值比較，就可以確定天敵捕食害蟲的頭數(shù)，即Qo值。如食蟲溝瘤蛛取食1頭白背飛虱或褐飛虱的高齡幼蟲時，其A值為0.13或0.14.以1993年5月18日的檢測結(jié)果為例，食蟲溝瘤蛛對白背飛虱和褐飛虱檢測的A值分別為0.14,0,0,0.0.09,0,0和0,0,0.23,0,0,0.在白背飛虱的檢測中，0.14大于0.13代表捕食了2頭白背飛虱：0.09代表捕食了1頭：褐飛虱檢測中，0.23代表捕食了2頭。二者相加代表了每頭捕食者當天的捕食量，即Qo值。tDP可由實驗測出。根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，得出的食蟲溝瘤蛛在1993年早稻群落中的捕食量。結(jié)果表明食蟲溝瘤蛛在早稻群落早期對飛虱的控制作用大于中、后期。

   這種評價方法仍是自然捕食活動的一種估計。在不同條件下不同個體的捕食者其捕食效應有差別，不同個體在不同條件下的消化速率也不一樣，還有重捕食作用等。因此，如何通過血清學結(jié)果更準確地反映捕食者的作用有待于進一步研究。

    ELISA分析儀器

    ELISA試劑技術(shù)20世紀80年代引入中國，現(xiàn)已被廣泛應用。與之相關(guān)的分析儀器也得到了快速發(fā)展，我國先后出現(xiàn)了十余家酶標儀、洗板機生產(chǎn)廠商，在中國市場上與眾多的進口酶標儀器進行緊張競爭。下面分三個方面對ELISA中有關(guān)儀器及其在中國的應用作一簡要介紹。

      分離式酶聯(lián)免疫儀器

    分離式酶聯(lián)免疫儀器主要有酶標儀、洗板機。在血清離心之后，經(jīng)過加樣、洗板、孵育等過程，zui后通過吸光度判定結(jié)果。ELISA實驗在國內(nèi)主要用于定性檢驗，故目前的分離式儀器基本上可以滿足。

    酶標儀本質(zhì)上是一臺于微孔板的、可見光范圍的光電比色計。在ELISA實驗中，酶標儀是測定各微孔中試樣的吸光度的關(guān)鍵儀器，對試驗結(jié)果的判定有直接影響，是實驗室*的重要儀器之一。隨著ELISA技術(shù)的普及，酶標儀得到了很大發(fā)展，產(chǎn)品種類齊全，型號多樣，各有特色。目前國內(nèi)市場上銷售的酶標儀已*擺脫原來的單孔測量方式，整板測量、定性定量計算、存儲、多種報告格式、濾光片自動轉(zhuǎn)換等已成為基本的、*的功能，各種新推出的酶標儀性能日益完善，功能不斷擴充。具體有：

（1）       測量高速化  從目前不斷推出的酶標儀趨勢來看，整板測量速度均在10s以內(nèi)，這有利于防止測量過程中各微孔吸光度的微小變化，盡可能克服環(huán)境對結(jié)果的影響，同時可以滿足動力測量的要求，測量速度在20s以上的儀器將處于不利于地位。我國現(xiàn)生產(chǎn)的酶標儀，測量整板速度一般為25s,產(chǎn)品更新周期較長。

（2）       寬吸光度范圍   盡管酶標儀A=0-2.5的吸光度范圍*可以滿足實驗的要求，但國外新推出的儀器都擴寬了早期型號的吸光度范圍，較的酶標儀其線性范圍可以達到A=4.0，并且保持很好的精密度，如BIORAD公司的Benchmark,在400-750nm、A=0-4.0時其重復性與線性均不大于3.5%。又如LABYSTEMS公司的Multi-skan Ascent,其吸光度讀數(shù)范圍達A=0-4.0，在A=3.0-4.0范圍，其線性不超過2%, RSD小于1.0%。

（3）       擴展到紫外  增加紫外濾光片幾乎是廠商的共同選擇。由于各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的機構(gòu)，可以同時安裝6-8片濾光片，擴展紫外功能相對容易，一般都增加340nm濾光片。

（4）       具有孵育功能  可以自動、控制反應溫度，使微孔板的孵育過程在儀器內(nèi)部完成，降低外界干擾，簡化操作步驟。如BIORAD公司的Benchmark,芬蘭LABSYSTEMS公司的Multiskan  Ascent,BIOTCK公司的EIX808等。

（5）       具有動力學檢測功能   常規(guī)ELISA是一種終點法測量實驗，測量前需要加入終止液來抑制酶免反應的進行，通過吸光度的大小來計算待測物質(zhì)的濃度，動力學方法是通過測定反應過程中吸光度的變化速率來計算相應的待測物質(zhì)的含量的，酶標儀的測量速度加快后，只要增加相應的軟件，就可以使用酶標儀完成某些生化指標的動力學測量。

洗板機是ELISA試驗保證洗滌效果、進而保證實驗質(zhì)量的重要儀器，洗板機的作用已不再是簡單的代替人的手工勞動的自動化裝置。目前國內(nèi)的洗板機除提供常規(guī)的設(shè)備清洗次數(shù)、清洗條數(shù)、浸泡時間等基本功能之外，還根據(jù)用戶的需要分別增加了底部沖洗、兩點吸液、板式/條式洗板、震蕩、位置調(diào)節(jié)及自動清洗管路、自動換液存儲多種洗板程序等功能，清洗殘留量由原來的5-6UL/孔減小到2UL/孔，有的洗板機允許用戶對洗板過程的每一步的流量、時間、位置等進行詳盡的設(shè)定。生產(chǎn)廠商根據(jù)各自對洗板技術(shù)的研究，努力提高儀器可靠性與自動化程度，同時為用戶提供一個*的、完善的洗滌環(huán)境。國內(nèi)洗板機就洗板效果、產(chǎn)品可靠性等主要指標已達到進口以前的水平，與進口儀器相比，其價格、售后服務(wù)占一定優(yōu)勢，主要差距是無定量加液。

組合式的酶聯(lián)免疫儀器

 組合式的酶聯(lián)免疫儀器分三類：全自動酶聯(lián)免疫系統(tǒng)、自動樣品處理系統(tǒng)、流水線作業(yè)式組合系統(tǒng)。前兩者主要用于各大血站、醫(yī)院，后者主要用于試劑生產(chǎn)廠商。

全自動酶聯(lián)免疫系統(tǒng)是將ELISA試驗中的各個步驟，從加樣、孵育、洗滌、震蕩、閉塞到定性或定量分析、報告存儲與打印功能全部集成在一臺儀器中，由儀器按用戶事先設(shè)計的程序自動進行。HAMILTON公司的FAME（世界上*臺自動板式ELISA系統(tǒng)）、BIORAD公司的CAA、奧斯邦公司的AMP、TECAN公司的Minilyser、ORGANO公司的TEKTIME、意大利S.P.A. DIVISION  STRUMENTI的PersonaiLAB等全自動酶聯(lián)免疫系統(tǒng)已先后進入國內(nèi)市場。近兩年新進入中國市場還有DYNDRX、公司的DSX、 阿克蘇公司的Flextk2、BIOASIA代理的TRITURUS等。全自動酶聯(lián)免疫系統(tǒng)的出現(xiàn)滿足了各大醫(yī)院、血站大批量重復檢驗的要求，提高了這些單位的檢查檢驗效率與實驗水平，有效控制了大批量檢驗中極有可能出現(xiàn)的人工操作失誤，有利于ELISA實驗的質(zhì)量保證與提高，其國內(nèi)市場穩(wěn)步增長。

自動樣品處理系統(tǒng)主要用于完成ELISA實驗中的繁瑣無味、人工容易出錯的加樣、稀釋滴定、孵育、洗滌等步驟，完成之后再由酶標儀判定結(jié)果。使用自動樣品處理系統(tǒng)利用原有的酶標儀，既節(jié)約資金，又實現(xiàn)了實驗過程的自動化，是一種很經(jīng)濟的方案。TECAN公司推出了面向中國血站的MINITRED自動樣品系統(tǒng)，國內(nèi)市場上常見的HYPERI-ON公司的HYPREPTTLUS、DYNEX公司的UItra等。